摘要：
目的 克隆狂犬病毒(RABV)L蛋白的加帽酶功能域基因,构建原核表达载体,制备了多克隆抗体,为病毒诊断和抗病毒药物研发提供了有效工具.方法 利用基因工程技术,扩增L蛋白加帽酶功能域的基因序列,与双酶切的pET-32a载体连接,获得pET-32a-RABV-L重组表达质粒.经过测序确认无碱基突变,将含pET-32a-RABV-L重组表达质粒的菌液扩大培养后,IPTG诱导表达重组蛋白.通过Ni-NTA亲和层析填料进行纯化,改变不同咪唑洗脱浓度,摸索出适合的洗脱条件.将纯化的蛋白与弗氏佐剂混合免疫小鼠,获得的小鼠多克隆抗体进行间接ELISA检测、Western blot检测、IFA检测.结果 成功构建pET-32a-RABV-L原核表达质粒.RABV-L重组蛋白在大肠埃希菌中成功表达,大小约40 ku,且与His-tag的单克隆抗体发生特异性反应.免疫小鼠64 d后,采取的小鼠血清制备多克隆抗体,其工作效价达到25 600,在Western blot检测和IFA检测中显示能特异性识别天然病毒L蛋白.结论 成功表达、纯化RABV-L蛋白加帽酶功能域的重组蛋白,并成功获得特异性识别天然表位的多克隆抗体.
