目的:阐明2018—2020年云南省手足口病优势肠道病毒感染类型及柯萨奇病毒A组4型(CVA4)VP1基因特征分析。方法:手足口病监测肠道病毒实时荧光定量PCR核酸阳性标本进一步病毒分离，送中国疾病预防控制中心并对VP1基因测序分析。结果:2018—2020年共采集手足口病标本21 757份，其中阳性标本16 457份，阳性检出率75.64%。共分离阳性标本4 114份，分离到毒株533份，其中肠道病毒71型(EVA71)共89例，占总病原的16.70%；柯萨奇病毒A组16型(CVA16)共180例，占33.77%；CVA10为76例，占14.26%；CVA6、CVA4分别占22.14%、4.88%；其他型别共44例，占8.26%。5岁以下儿童是手足口患者主要人群，男女性别比1.35∶1，气温较高的第二、三季度是手足口病高发季。云南省CVA4主要分布在曲靖和昆明等地，文山、红河零星分布，VP1基因全长915 bp，26株CVA4毒株均属于C基因型的C2亚型，与原始株AY421762-HighPoint之间遗传距离较远。VP1基因的18、23、34、102、148、164、200、262、174、275、285、303等位点均有不同程度的突变。核苷酸同源性为80.4%~99.0%，氨基酸同源性为95.6%~99.0%，核苷酸突变多为有义突变。结论:CVA16、EVA6、EVA71和CVA10为云南省2018—2020年手足口病的优势肠道病毒。CVA4渐成为引起手足口病不可忽视的病原体，云南省CVA4属于C基因型的C2亚型，主要流行于云南省的东部及东南部，渐成为持续共循环优势株，长期动态监测对于提高手足口病预警敏感性具有重要的公共卫生意义。