资源类型：
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◇ 卓越：梯队期刊
文章类型：
机构：
[1]昆明理工大学附属医院云南省第一人民医院临床基础医学研究所云南省出生缺陷与遗传病研究重点实验室云南省临床病毒学重点实验室,昆明 650032
首都医科大学附属北京儿童医院
云南省第一人民医院
[2]华中科技大学同济医学院生殖医学中心(武汉同济生殖医学专科医院),武汉 430030
[3]云南省第三人民医院生殖遗传科,昆明 650011
出处：
ISSN：
关键词：
ALOX5
CRISPR/Cas9
基因敲除
构建
质粒
摘要：
旨在利用CRISPR/Cas9技术构建敲除花生四烯5-脂氧合酶基因(Arachidonate 5-lipoxygenase gene,ALOX5)的重组质粒.设计合成3对靶向敲除ALOX5第六外显子的sgRNA,将其分别插入到CRISPR/Cas9质粒骨架pX458载体中,转化感受态大肠杆菌DH5α后挑取克隆,通过测序评估重组质粒是否构建成功.将构建好的重组质粒转染293T细胞,在荧光显微镜下观察转染效果,挑取转染成功的细胞,用试剂盒提取转染细胞基因组DNA,PCR扩增含敲除位点的DNA片段,用测序技术获得核苷酸序列,用DNAStar软件分析转染细胞中ALOX5基因敲除情况.测序结果表明2对双链sgRNA寡核苷酸已插入质粒,且序列正确,靶向ALOX5基因的重组质粒pX458-sgRNAs-ALOX5构建成功.其在293T细胞中的转染效率约为50％,用一代测序法未检测到sgRNAs的切割效果.初步表明利用CRISPR/Cas9技术成功构建靶向ALOX5基因的重组质粒pX458-sgRNAs-ALOX5.
基金：
国家自然科学基金项目(31460298)%云南省卫生厅内设机构资助项目(2016NS225)%云南省科技厅-昆医联合专项(2015FB102)
基金编号：
31460298
第一作者：
第一作者机构：
[1]昆明理工大学附属医院云南省第一人民医院临床基础医学研究所云南省出生缺陷与遗传病研究重点实验室云南省临床病毒学重点实验室,昆明 650032
[2]华中科技大学同济医学院生殖医学中心(武汉同济生殖医学专科医院),武汉 430030
共同第一作者：
通讯作者：
推荐引用方式(GB/T 7714)：
梅芬,李瑞玮,张娟娟,等.构建基于CRISPR/Cas9技术敲除ALOX5的质粒[J].生物技术通报.2020,36(03):110-114.
